Analisa Protein Metode Kjeldahl

ANALISA PROTEIN

Metode Kjeldahl

Metode Kjeldahl merupakan metode yang sederhana untuk penetapan nitrogen total pada asam amino, protein dan senyawa yang mengandung nitrogen. Sampel didestruksi dengan asam sulfat dan dikatalisis dengan katalisator yang sesuai sehingga akan menghasilkan amonium sulfat. Setelah pembebasan dengan alkali kuat, amonia yang terbentuk disuling uap secara kuantitatif ke dalam larutan penyerap dan ditetapkan secara titrasi. Metode ini telah banyak mengalami modifikasi. Metode ini cocok digunakan secara semimikro, sebab hanya memerlukan jumlah sampel dan pereaksi yang sedikit dan waktu analisa yang pendek. Metode ini kurang akurat bila diperlukan pada senyawa yang mengandung atom nitrogen yang terikat secara langsung ke oksigen atau nitrogen. Tetapi untuk zat-zat seperti amina,protein,dan lain – lain hasilnya lumayan.

Cara Kjeldahl digunakan untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen.

Prinsip cara analisis Kjeldahl adalah sebagai berikut: mula-mula bahan didestruksi dengan asam sulfat pekat menggunakan katalis selenium oksiklorida atau butiran Zn. Amonia yang terjadi ditampung dan dititrasi dengan bantuan indikator. Cara Kjeldahl pada umumnya dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro.

1.      Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar   contoh 1-3 g

2.      Cara semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen.

Cara analisis tersebut akan berhasil baik dengan asumsi nitrogen dalam bentuk ikatan N-N dan N-O dalam sampel tidak terdapat dalam jumlah yang besar. Kekurangan cara analisis ini ialah bahwa purina, pirimidina, vitamin-vitamin, asam amino besar, kreatina, dan kreatinina ikut teranalisis dan terukur sebagai nitrogen protein. Walaupun demikian, cara ini kini masih digunakan dan dianggap cukup teliti untuk pengukuran kadar protein dalam bahan makanan.

Analisa protein cara Kjeldahl pada dasarnya dapat dibagi menjadi tiga tahapan yaitu proses destruksi, proses destilasi dan tahap titrasi.

1.      Tahap destruksi

Pada tahapan ini sampel dipanaskan dalam asam sulfat pekat sehingga terjadi destruksi menjadi unsur-unsurnya. Elemen karbon, hidrogen teroksidasi menjadi CO, CO₂ dan H₂O. Sedangkan nitrogennya (N) akan berubah menjadi (NH₄)₂SO₄. Untuk mempercepat proses destruksi sering ditambahkan katalisator berupa campuran Na₂SO₄ dan HgO (20:1). Gunning menganjurkan menggunakan K₂SO₄ atau CuSO₄. Dengan penambahan katalisator tersebut titk didih asam sulfat akan dipertinggi sehingga destruksi berjalan lebih cepat. Selain katalisator yang telah disebutkan tadi, kadang-kadang juga diberikan Selenium. Selenium dapat mempercepat proses oksidasi karena zat tersebut selain menaikkan titik didih juga mudah mengadakan perubahan dari valensi tinggi ke valensi rendah atau sebaliknya.

Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah:

     H              destruksi

R-C-COOH                    NH₃     + CO₂     + H₂O

   NH₂                                H₂SO₄

Asam amino  CuSO₄

(protein)           Na₂SO₄

NH₃ + H₂SO₄                    (NH₄)₂SO₄ 

                                                 Hasil Destruksi

2.      Tahap destilasi

Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH₃) dengan penambahan NaOH sampai alkalis dan dipanaskan. Agar supaya selama destilasi tidak terjadi superheating ataupun pemercikan cairan atau timbulnya gelembung gas yang besar maka dapat ditambahkan logam zink (Zn). Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh asam khlorida atau asam borat 4 % dalam jumlah yang berlebihan. Agar supaya kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam. Untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebihan maka diberi indikator misalnya BCG + MR atau PP.

Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah:

(NH₄)₂SO₄  +  NaOH                   NH₃      + H₂O + Na₂SO₄

NH₃     + HCl 0,1 N                        NH₄Cl

             Berlebihan

3.      Tahap titrasi

Apabila penampung destilat digunakan asam khlorida maka sisa asam khorida yang bereaksi dengan ammonia dititrasi dengan NaOH standar (0,1 N). Akhir titrasi ditandai dengan tepat perubahan warna larutan menjadi merah muda dan tidak hilang selama 30 detik bila menggunakan indikator PP.

Reaksi yang terjadi pada tahap ini adalah:

HCl 0,1 N + NaOH 0,1 N                  NaCl +  H₂O

Kelebihan

            Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut:

%N = ml NaOH blanko – ml NaOH sampel × N. NaOH × 14,008 × 100%

                      Gram bahan x 1000

Apabila penampung destilasi digunakan asam borat maka banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia dapat diketahui dengan titrasi menggunakan asam khlorida 0,1 N dengan indikator (BCG + MR). Akhir titrasi ditandai dengan perubahan warna larutan dari biru menjadi merah muda.

            Kandungan nitrogen kemudian dapat dihitung sebagai berikut:

%N = ml NaOH blanko – ml NaOH sampel × N. HCl × 14,008 × 100%

                                            Gram bahan x 1000

Setelah diperoleh %N, selanjutnya dihitung kadar proteinnya dengan mengalikan suatu faktor. Besarnya faktor perkalian N menjadi protein ini tergantung pada persentase N yang menyusun protein dalam suatu bahan.

Kadar protein (%) = % N x faktor konversi

Nilai faktor konversi berbeda tergantung sampel:

1.      Sereal                     5,7

2.      Roti                        5,7

3.      Sirup                      6,25

4.      Biji-bijian               6,25

5.      Buah                      6,25

6.      Beras                      5,95

7.      Susu                       6,38

8.      Kelapa                   5,20

9.      Kacang Tanah        5,46

Apabila faktor konversi tidak diketahui, faktor 6,25 dapat digunakan . Faktor ini diperoleh dari fakta rata-rata nitrogen dalam protein adalah 16 %.

Kadar Protein (%)        = N x 100/16

                                    = N x 6,25     

                         

Analisa Protein Pada Kedelai

1.      Proses Destruksi

·        Ditimbang 1 g bahan yang telah dihaluskan, masukkan dalam labu Kjeldahl, namun karena kandungan protein tinggi pada kedelai  maka digunakan bahan kurang dari 1 g

·        Kemudian ditambahkan 7,5 g kalium sulfat dan 0,35 g raksa (II) oksida dan 15 ml asam sulfat pekat.

·        dipanaskan semua bahan dalam labu Kjeldahl dalam lemari asam sampai berhenti berasap dan diteruskan pemanasan sampai mendidih dan cairan  menjadi jernih. ditambahkan pemanasan kurang lebih 30 menit, dimatikan pemanasan dan dibiarkan sampai dingin.

·        Selanjutnya ditambahkan 100 ml aquadest dalam labu Kjeldahl yang didinginkan dalam air es dan beberapa lempeng Zn, tambahkan 15 ml larutan kalium sulfat 4% (dalam air) dan akhirnya ditambahkan perlahan-lahan larutan natrium hidroksida 50% sebanyak 50 ml yang telah didinginkan dalam lemari es.

2.      Proses Destilasi

·         Diipasang labu Kjeldahl dengan segera pada alat destilasi. Dipanaskan labu Kjeldahl perlahan-lahan sampai dua lapis cairan tercampur, kemudian dipanaskan dengan cepat sampai mendidih.

·         Destilat ditampung dalam Erlenmeyer yang telah diisi dengan larutan baku asam klorida 0,1N sebanyak 50 ml dan indicator merah metil 0,1% b/v (dalam etanol 95%) sebanyak 5 tetes, ujung pipa kaca destilator dipastikan masuk ke dalam larutan asam klorida 0,1N.

·         Proses destilasi selesai jika destilat yang ditampung lebih kurang 75 ml.

3.      Proses Titrasi

·         Sisa larutan asam klorida 0,1N yang tidak bereaksi dengan destilat dititrasi dengan larutan baku natrium hidroksida 0,1N. Titik akhir titrasi tercapai jika terjadi perubahan warna larutan dari merah menjadi kuning. Lakukan titrasi blanko.

Ada pun penentuan kadar protein kasar :

Protein Kasar = (y-z) X titar NaOH X 0,014 X 6,25  X 100%

                                   Berat Sampel (x) g

GAMBAR ALAT PENENTUAN NITROGEN DENGAN METODE KJELDAHL

Keuntungan Dan Kerugian Menggunakan Metode Kjeldahl

·        Kentungan menggunakan Metode Kjeldahl,diantaranya :

a.  Secara internasional dan masih merupakan metode standar untuk perbandingan terhadap semua metode lainnya.

b.   presisi tinggi dan baik reproduktifitas telah membuat metode utama untuk estimasi protein dalam makanan.

·      Kerugian menggunakan Metode Kjeldahl,diantaranya :

a.    memberikan ukuran protein yang benar, karena semua nitrogen dalam makanan tidak dalam bentuk protein.

b.    Protein yang berbeda memerlukan faktor koreksi yang berbeda karena mereka memiliki urutan asam amino yang berbeda.

c.       Penggunaan asam sulfat pekat pada suhu tinggi menimbulkan bahaya yang cukup besar, seperti halnya penggunaan beberapa kemungkinan katalis teknik ini memakan waktu untuk membawa keluar.

Pada analisa protein dengan menggunakan metode kjedahl untuk menganalisis kadar protein kasar dalam bahan makanan secara tidak langsung, karena yang dianalisis dengan cara ini adalah kadar nitrogennya. Dengan mengalikan hasil analisis tersebut dengan angka konversi 6,25, diperoleh nilai protein dalam bahan makanan itu. Untuk beras, kedelai, dan gandum angka konversi berturut-turut sebagai berikut: 5,95, 5,71, dan 5,83. Angka 6,25 berasal dari angka konversi serum albumin yang biasanya mengandung 16% nitrogen. Cara analisa protein dengan menggunakan metode kjeldahl dapat dibedakan atas dua cara, yaitu cara makro dan semimakro.

1.      Cara makro Kjeldahl digunakan untuk contoh yang sukar dihomogenisasi dan besar contoh 1-3 g.

2.      Cara semimikro Kjeldahl dirancang untuk contoh ukuran kecil yaitu kurang dari 300 mg dari bahan yang homogen.

Protein merupakan suatu zat makanan yang sangat penting bagi tubuh karena zat ini berfungsi sebagai sumber energi dalam tubuh serta sebagai zat pembangun dan pengatur. Protein adalah polimer dari asam amino yang dihubungkan dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandung unsur-unsur C, H, O, N, P, S, dan terkadang mengandung unsur logam seperti besi dan tembaga (Winarno, 1992).  (Lehninger, 1995).

Pada umumnya kadar protein di dalam bahan pangan menentukan mutu bahan pangan itu sendiri (S.A. & Suwedo H. ,1987). Nilai gizi dari suatu bahan pangan ditentukan bukan saja oleh kadar nutrien yang dikandungnya, tetapi juga oleh dapat tidaknya nutrien tersebut digunakan oleh tubuh (Muchtadi, 1989). Salah satu parameter nilai gizi protein adalah daya cernanya yang didefinisikan sebagai efektivitas absorbsi protein oleh tubuh (Del Valle, 1981). Berdasarkan kandungan asam-asam amino esensialnya, bahan pangan dapat dinilai apakah bergizi tinggi atau tidak. Bahan pangan bernilai gizi tinggi apabila mengandung asam amino esensial yang lengkap serta susunannya sesuai dengan kebutuhan tubuh.

Protein yang terdapat dalam bahan pangan mudah mengalami perubahan-perubahan, antara lain:

1.      Dapat terdenaturasi oleh perlakuan pemanasan.

2.      Dapat terkoagulasi atau mengendap oleh perlakuan pengasaman.

3.      Dapat mengalami dekomposisi atau pemecahan oleh enzim-enzim proteolitik.

4.      Dapat bereaksi dengan gula reduksi, sehingga menyebabkan terjadinya warna coklat.

Banyak agensia yang menyebabkan perubahan sifat alamiah dari protein seperti panas, asam, basa, pelarut organik, garam, logam berat, radiasi sinar radioaktif (Sudarmadji, 2010). Analisis protein ini terdiri dari beberapa tahapan yaitu: destruksi, destilasi, dan titrasi. Penentuan protein menurut Kjeldahl disebut juga penentuan kadar protein kasar (crude protein), yaitu menentukan jumlah total nitrogen (N) yang dikandung oleh suatu bahan untuk mewakili jumlah protein yang ada. Sampel yang dianalisis berupa ampas tahu (A; E), jagung (F; G), biskuit (B; C), dan susu (D; H), sampel kelompok 7 yaitu jagung.

a.       Proses destruksi (Oksidasi)

Tahapan pertama penentuan kadar protein ini yaitu destruksi, destruksiprotein meliputi gangguan dan kerusakan yang mungkin terjadi pada struktur sekunder dan tersier protein. Sampel sebanyak 0,51 g ditimbang, kemudian ditambahkan 0,04 g HgO dan 0,9 g K₂SO₄ sebagai katalis. Destruksi merupakanproses pengubahan N protein menjadi ammonium sulfat. Proses ini berlangsung selama sampel yang ditambah dengan katalisator direaksikan dengan H₂SO₄ pekat dan dididihkan di atas pemanas labu Kjeldahl. Penambahan asam sulfat dilakukan dalam ruang asam untuk menghindari S yang berada di dalam protein terurai menjadi SO₂ yang sangat berbahaya. Setelah penambahan asam sulfat larutan menjadi keruh. Asam sulfat pekat berfungsi untuk mendestruksi protein menjadi unsur-unsurnya, sedangkan katalisator berfungsi untuk mempercepat proses destruksi dan menaikkan titik didih asam sulfat. Tiap 1 gram K₂SO₄ menaikkan titik didih 3⁰C.

 Dari proses ini semua ikatan N dalam bahan pangan akan menjadi ammonium sulfat (NH₄SO4) kecuali ikatan N=N; NO; dan NO₂. Ammoniak dalam asam sulfat terdapat dalam bentuk ammonium sulfat. Pada tahap ini juga menghasilkan CO₂, H₂O, dan SO₂ yang terbentuk adalah hasil reduksi dari sebagian asam sulfat dan menguap. Reaksi yang terjadi selama destruksi: HgO +H₂SO₄ →  HgSO₄ + H₂O

2HgSO₄  → Hg₂SO₄  + SO₂ +2O_n

Hg₂SO₄  + 2H₂SO₄ →  2HgSO₄ + 2H₂O + SO₂

u2:shapes="Straight_x0020_Connector_x0020_3" v:shapes="_x0000_i1029">(CHON) + O_n + H₂SO₄                    CO₂ + H₂O + (NH₄)₂SO₄ + SO₂                                                            Katalisator                                                                                                            (Sudarmadji, 1996)

Proses pemanasan dilakukan ± 2 jam sampai larutan jernih.Larutan yang jernih menunjukkan bahwa semua partikel padat bahan telah terdestruksi menjadi bentuk partikel yang larut tanpa ada partikel padat yang tersisa. Larutan jernih yang telah mengandung senyawa (NH₄)₂SO₄ ini kemudian didinginkan supaya suhu sampel sama dengan suhu luar sehingga penambahan perlakuan lain pada proses berikutnya dapat memperoleh hasil yang diinginkan.

b. Proses Destilasi

            Pada tahap destilasi, ammonium sulfat dipecah menjadi ammonia (NH₃).Prinsip destilasi adalah memisahkan cairan atau larutan berdasarkan perbedaan titik didih. Dari hasil destruksi protein, labu destruksi didinginkan kemudian dilakukan pengenceran dengan penambahan aquades. Pengenceran dilakukan untuk mengurangi kehebatan reaksi bila ditambah larutan alkali. Larutan dijadikan basa dengan menambahkan 10 mL NaOH 60%, lalu corong ditutup dan ditambahkan aquades ± setengah bagian. Sampel harus dimasukkan terlebih dahulu kedalam alat destilasi sebelum NaOH, karena untuk menghindari terjadinya superheating. Fungsi penambahan NaOH adalah untuk memberikan suasana basa karena reaksi tidak dapat berlangsung dalam keadaan asam

            Ammonia yang dibebaskan selanjutnya akan ditangkap oleh larutan asam standar. Untuk menampung NH₃ yang keluar, digunakan asam borat dalam erlenmeyer sebanyak 15 mL dan telah ditambahkan indikator Toshiro (Metil Merah + Metil Biru), menghasilkan larutan berwarna biru tua. Indikator ini digunakan untuk mengetahui asam dalam keadaan berlebih. Hasil destilasi (uap NH₃ dan air) ditangkap oleh larutan H₃BO₃ yang terdapat dalam labu erlenmeyer dan membentuk senyawa (NH₄)₃BO₃. Senyawa ini dalam suasana basa akan melepaskan NH₃. Agar kontak antara asam dan ammonia lebih baik maka diusahakan ujung tabung destilasi tercelup sedalam mungkin dalam asam borat. Penyulingan dihentikan jika semua N sudah tertangkap oleh asam borat dalam labu erlenmeyer atau hasil destilasi tidak merubah kertas lakmus merah serta menghasilkan larutan berwarna hijau jernih. Ujung selang dibilas dengan aquades, agar tidak ada ammonia yang tertinggal di selang. Reaksi yang terjadi:     

u2:shapes="Straight_x0020_Connector_x0020_19" v:shapes="_x0000_i1031">(NH₄)SO₄  + NaOH                Na₂SO₄ + 2 NH₄OH

u2:shapes="Straight_x0020_Connector_x0020_18" v:shapes="_x0000_i1032"> 2NH₄OH                    2NH₃ + 2H₂O

  4NH₃ + 2H₃BO₃                2(NH₄)₂BO₃ +H₂

c. Proses Titrasi

            Titrasi merupakan tahap akhir pada penentuan kadar protein dalam bahan pangan ini. Banyaknya asam borat yang bereaksi dengan ammonia (N) dapat diketahui dengan  volume  HCl 0,02 N yang dibutuhkan destilat. Titik akhir titrasi dihentikan sampai larutan berubah dari hijau ke biru (kembali ke warna awal). Selisih jumlah titrasi blanko dan sampel merupakan jumlah ekuivalen nitrogen.

            Dari analisa yang telah dilakukan, volume yang digunakan untuk menitrasi sampel sebanyak 5,37 mL HCl 0,02 N. Sehingga diperoleh kadar protein pada jagung sebesar 8,84%, sedangkan pada literatur sebesar 5,1%. Hal ini dapat terjadi dikarenakan proses analisa terutama titrasi yang tidak tepat, dapat terlalu berlebihan atau kekurangan yang berpengaruh terhadap volume HCl yang digunakan untuk titrasi, sehingga mempengaruhi  hasil perhitungan kadar protein kasar.

           

DAFTAR PUSTAKA

Arsyad,M,Natsir,2001, KAMUS KIMIA ARTI DAN PENJELASAN ISTILAH, PT Gramedia Pustaka Utama, Jakarta

Anonymous,2009, ANALISA PROTEIN,http://mgmpkimiasumbar.wordpress.com/2009/02/11/reaksi-analisa-protein/, diakses tanggal 13 Maret 2009

Anonymous,2009, KJELDAHL,http://kisahfathe.blogspot.com/2009/02/kjeldahl.html, diakses tanggal 13 Maret 2009

Anonymous,2009, ANALISA PROTEIN,http://translate.google.co.id/translate?hl=id&langpair=en|id&u=http://www-unix.oit.umass.edu/~mcclemen/581Proteins.html, diakses tanggal 14 Maret 2009

Anonymous,2009, PROSEDUR ANALISA LABOTARIUM,damandiri.or.id/file/muhamadjuraidwatiheluwipblampiran.pdf, di akses tanggal 14 Maret 2009

Fatmawaty,2009, KJELDAHL, http://www.turbovista.com/quantitative-analysis.php.htm, diakses tanggal 13 Maret 2009

Anna Poedjiadi, 1994. Dasar-Dasar Biokimia. Penerbit UI-Press: Jakarta.

Del Valle, F.R. 1981. Nutritional Qualities of Soya Protein as Affected by Processing. JAOCS.58 : 519

Lehninger.A.L, 1995.Dasar-Dasar Biokimia. Erlangga, Jakarta

Muchtadi, 1989.Evaluasi Nilai Gizi Pangan.Departemen Pendidikan dan Kebudayaan Jenderal Pendidikan Pusat Antar Universitas Pangan dan Gizi IPB Bogor.

Sudarmadji, S., Haryono, B., Suhardi, 1996. Analisa Bahan Makanan dan Pertanian. Penerbit Liberty: Yogyakarta.

Winarno, F. G., 1992. Kimia Pangan dan Gizi. Penerbit Gramedia: Jakarta.